изотермальная амплификация что это

Петлевая изотермическая амплификация

Определение в пробирке амплификации ДНК LAMP возможно с использованием нагруженного марганцем кальцеина, который начинает флуоресцировать при комплексообразовании марганца с пирофосфатом во время синтеза ДНК in vitro. [8]

Другой метод визуального обнаружения LAMP-ампликонов невооруженным глазом был основан на их способности гибридизоваться с комплементарной ss-ДНК, связанной с золотом, и, таким образом, предотвращать нормальное изменение цвета с красного на пурпурно-синий, которое в противном случае произошло бы во время индуцированной солью агрегации золотые частицы. Таким образом, метод LAMP в сочетании с обнаружением ампликона с помощью AuNP может иметь преимущества по сравнению с другими методами с точки зрения сокращения времени анализа, подтверждения ампликона гибридизацией и использования более простого оборудования (например, отсутствие необходимости в термоциклере, оборудовании для электрофореза или УФ-трансиллюминаторе. ). [9] [10]

LAMP менее универсален, чем ПЦР, наиболее хорошо зарекомендовавший себя метод амплификации нуклеиновых кислот. LAMP полезен в первую очередь как метод диагностики или обнаружения, но не пригоден для клонирования или многих других приложений молекулярной биологии, поддерживаемых ПЦР. Поскольку LAMP использует 4 (или 6) праймеров, нацеленных на 6 (или 8) областей в пределах довольно небольшого сегмента генома, и поскольку дизайн праймеров подвержен многочисленным ограничениям, сложно разработать наборы праймеров для LAMP «на глаз». Бесплатные пакеты программного обеспечения с открытым исходным кодом [25] или коммерческие пакеты обычно используются для помощи в разработке праймера LAMP, хотя ограничения дизайна праймера означают, что свобода выбора целевого сайта меньше, чем при использовании ПЦР.

В диагностическом приложении это должно быть сбалансировано с необходимостью выбора подходящей мишени (например, консервативного сайта в очень вариабельном вирусном геноме или мишени, специфичной для определенного штамма патогена). Для охвата различных вариантных штаммов одного и того же вида может потребоваться несколько вырожденных последовательностей. Следствием наличия такого набора праймеров может быть неспецифическая амплификация на поздней стадии амплификации.

Подходы к мультиплексированию для LAMP менее развиты, чем для ПЦР. Большее количество праймеров на мишень в LAMP увеличивает вероятность взаимодействий праймер-праймер для мультиплексированных наборов мишеней. Продукт LAMP представляет собой серию конкатемеров целевой области, приводящую к появлению характерной «лестницы» или полосатого рисунка на геле, а не одной полосы, как в случае ПЦР. Хотя это не проблема при обнаружении одиночных мишеней с помощью LAMP, «традиционные» (конечные) приложения мультиплексной ПЦР, в которых идентичность цели подтверждается размером полосы на геле, невозможны с LAMP. Мультиплексирование в LAMP было достигнуто путем выбора целевой области с сайтом рестрикции и переваривания перед запуском в гель, так что каждый продукт дает определенный размер фрагмента [26], хотя этот подход добавляет сложности к экспериментальной конструкции и протокол.

Зеленый краситель SYBR может быть добавлен для просмотра LAMP в режиме реального времени. Однако в поздней амплификации амплификация димера праймера может способствовать ложноположительному сигналу. Использование неорганической пирофосфатазы в реакционной смеси SYBR позволяет использовать анализ расплава для определения правильной амплификации [28]

Хотя для ложноположительных результатов в анализах, основанных на этом методе, были предложены различные стратегии смягчения последствий, неспецифическая амплификация из-за различных факторов, включая отсутствие механизмов стробирования температуры, является одним из основных ограничений петлевой изотермической амплификации. [29] [30]

Источник

#28 Петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК (LAMP и RT-LAMP): решения New England Biolabs

Долгое время основным методом амплификации нуклеиновых кислот оставалась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако современные подходы к молекулярной диагностике (например, point-of-care) требуют более простых, быстрых и дешевых способов получения результатов, чем ПЦР.

Из этого обзора вы узнаете:

Принцип методов LAMP и RT-LAMP

Оригинальный протокол метода LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) был предложен японскими учеными 20 лет 1 назад. Он заключался в использовании для амплификации ДНК четырех олигонуклеотидных праймеров и большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы, обладающего сильной вытесняющей активностью.

Четыре праймера должны быть специфичны к 6 участкам целевого фрагмента:
F3 – прямой наружный праймер, комплементарный участку F3c, B3 – обратный наружный праймер, комплементарный участку B3c, FIP – прямой внутренний праймер состоит из двух частей: F1c (5’) и F2 (3’), комплементарных участкам F1 и F2c, соответственно, BIP – обратный внутренний праймер состоит из двух частей: B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно.

Процесс амплификации методом LAMP можно разделить на три основных этапа: 1) образование базовой гантелеобразной структуры, 2) этап циклической амплификации, 3) этап элонгации и повторения циклов.

В результате такой реакции образуется множество конкатемеров инвертированных повторов целевого фрагмента, формирующих в пространстве структуры, похожие на цветную капусту (cauliflower-like structures). И если длина участка-мишени обычно составляет 80-250 н.п., то длина конкатемеров может достигать 20 т.п.н. и больше.

Чуть позже авторы метода предложили его усовершенствованную модификацию, предполагающую использование уже 6 праймеров, специфичных к 8 участкам целевого фрагмента. Еще два петлевых праймера LoopF и LoopB должны быть комплементарны последовательностям между участками F1 и F2, а также B1 и B2 фрагмента-мишени. Они вступают в игру на третьем этапе реакции, отжигаясь на одноцепочечных участках образовавшихся ранее петель ДНК и становясь дополнительными центрами инициации полимеризации.

Также разработчики LAMP показали, что в качестве матрицы можно использовать и РНК, если добавить в реакционную смесь обратную транскриптазу. Такой вариант метода называется RT-LAMP (reverse transcription—coupled LAMP). Позднее компания New England Biolabs разработала версию 3.0 Bst ДНК-полимеразы, обладающую ревертазной активностью и исключающую необходимость использования в реакции еще одного фермента (см. ниже).

Пожалуй, самой сложной частью дизайна LAMP-эксперимента является подбор праймеров. И даже встречаются рекомендации тестировать не один комплект из 4-6 олигонуклеотидов. К счастью, уже разработаны специальные программы для автоматического подбора праймеров для LAMP/RT-LAMP.

Одна из самых популярных программ подобного рода PrimerExplorer доступна онлайн по адресу http://primerexplorer.jp/e/. На этом же ресурсе можно скачать руководство с требованиями к LAMP-праймерам.

Разработка тест-систем на основе LAMP предполагает не только дизайн праймеров, но и определение их оптимальных концентраций. Кроме того, необходимо подобрать концентрацию ионов магния, температуру реакции, подходящий буфер.

Иногда эффективность и специфичность реакции могут повысить дополнительные компоненты, например, L-пролин или Tte UvrD ДНК-геликаза. А для борьбы с контаминацией вследствие переноса можно использовать систему дУТФ/УДГ (см. ниже).

Способы детекции продуктов LAMP/RT-LAMP

Конечно, можно воспользоваться классическим методом агарозного гель-электрофореза. Поскольку в ходе LAMP образуются ДНК-конкатемеры кратной длины, то при их разделении в геле формируется лестница бэндов. Дорожки с отрицательными результатами или отрицательными контролями остаются пустыми (Рис. 3, СЛЕВА). Однако этот способ относительно трудоемок и времязатратен.

Гораздо проще по завершении LAMP окрасить реакционную смесь интеркалирующим красителем (SYBR Green, бромистый этидий, пропидиум йодид, PicoGreen и др.) и посмотреть на нее в УФ свете (Рис. 3, ПО ЦЕНТРУ). Более того, следить за изменением флуоресценции окрашенной реакционной смеси можно прямо в ходе процесса с помощью реал-тайм амплификатора или специального реал-тайм флуориметра для LAMP (Рис. 3, СПРАВА).

Некоторые исследователи используют для реал-тайм LAMP/RT-LAMP не красители, а различные варианты FIP или BIP флуоресцентных зондов. В частности, для мультиплексной реал-тайм LAMP/RT-LAMP были предложены FIP/BIP DARQ-зонды 3 (Рис. 4).

Также о результатах LAMP/RT-LAMP можно судить по косвенным признакам. Например, в ходе полимеризации ДНК активно образуется побочный продукт реакции – пирофосфат. При его взаимодействии с ионами магния в реакционной смеси образуется нерастворимая соль, замутняющая раствор. Если реакция идет достаточно долго, то это помутнение можно увидеть даже невооруженным глазом. Но для быстрой детекции продуктов по мутности рекомендуется использовать реал-тайм турбидиметр (Рис. 5).

Другими побочными продуктами, которые накапливаются в большом количестве, являются протоны. И если используемый буфер обладает не очень большой емкостью, pH раствора может заметно сдвинуться в кислую сторону.

Этот эффект лег в основу колориметрического метода детекции продуктов LAMP с помощью pH-чувствительных красителей (например, фенолового, крезолового или нейтрального красного). Будучи добавленными в реакционную смесь, они меняют свой цвет в ходе реакции (см. ниже).

О других методах детекции продуктов LAMP вы можете узнать из статьи Becherer et al. 4

Преимущества LAMP/RT-LAMP перед ПЦР для молекулярной диагностики

В таблице ниже мы сравнили методы LAMP и ПЦР по основным характеристикам, имеющим значение для современной молекулярной диагностики.

*При использовании Bst 3.0 ДНК-полимеразы от NEB

Для эффективной LAMP-амплификации достаточно меньше 10 копий целевого участка в исходной реакционной смеси. И иногда из-за меньшей чувствительности к примесям и ингибиторам в качестве образца можно использовать даже грубые лизаты и биологические жидкости.

Продукция New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP

В качестве продуктов для LAMP/RT-LAMP New England Biolabs предлагает различные версии Bst ДНК-полимеразы с буферами, готовые наборы, а также вспомогательные компоненты для увеличения специфичности и борьбы с контаминацией.

Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент (арт. M0275 L/S/M)

Bst 2.0 ДНК-полимераза (арт. M0537 L/S/M)

Эта разработанная in silico, усовершенствованная версия Bst ДНК-полимеразы характеризуется повышенной скоростью амплификации и увеличенным выходом реакции. Также фермент отличается большей термостабильностью и толерантностью к концентрации соли, что обеспечивает гибкость условий реакции.

Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза (арт. M0538 L/S/M)

Представляет собой вариант Bst 2.0 ДНК-полимеразы, который при температуре ниже 45°C нековалентно связан с аптамером, ингибирующем его активность. Это позволяет готовить реакционную смесь при комнатной температуре, не опасаясь преждевременного начала полимеризации.

Bst 3.0 ДНК-полимераза (арт. M0374 L/S/M)

Представляет собой еще более усовершенствованную версию Bst ДНК-полимеразы. Помимо всех преимуществ Bst 2.0 ДНК-полимеразы фермент обладает сильной ревертазной активностью вплоть до температуры 72°C. Это позволяет ставить реакцию RT-LAMP без добавления обратной транскриптазы.

Таблица сравнения различных версий Bst ДНК-полимеразы New England Biolabs

Набор для петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК (арт. E1700 L/S)

Набор включает в себя готовую реакционную смесь для LAMP и RT-LAMP. Всё, что вам нужно будет в нее добавить, – матрицу, смесь праймеров и воду. Набор совместим с различными методами детекции. В комплект поставки входит флуоресцентый краситель для измерения флуоресценции продуктов в режиме реального времени.

Готовая смесь для колориметрической петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК (арт. M1800 L/S)

Готовая смесь содержит Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразу, WarmStart® RTx обратную транскриптазу, буфер с низкой емкостью, дНТФ и pH-чувствительный краситель. Детекция продуктов осуществляется колоримерическим методом: смеси, в которых накапливается продукт, в ходе реакции меняют свой цвет с красного на желтый.

WarmStart® RTx обратная транскриптаза (арт. M0380 L/S)

Эта ревертаза была специально разработана для RT-LAMP, хотя ее можно использовать и для обычного синтеза кДНК. Одно из достоинств фермента – отсутствие активности при комнатной температуре.

Tte UvrD ДНК-геликаза (арт. M1202 S)

Эта термостабильная геликаза из бактерий Thermoanaerobacter tengcongensi способна расплетать широкий спектр дцДНК-субстраторв. При добавлении в реакционную LAMP/RT-LAMP-смесь она может существенно повышать специфичность амплификации.

Антарктическая термолабильная урацил-ДНК-гликозилаза (арт. M0372 L/S)

Поскольку LAMP/RT-LAMP – это очень чувствительный метод, то вероятность контаминации смеси продуктами предыдущих реакций для него еще больше, чем для ПЦР. И это нужно учитывать при организации рабочего пространства и дизайне эксперимента.

Помимо стандартных мер предосторожности, одним из способов борьбы с контаминацией вследствие переноса является добавление в реакционную смесь дУТФ и предварительная обработка реакционных смесей антарктической термолабильной урацил-ДНК-гликозилазой.

Она высвободит урацил из продуктов предыдущих LAMP, если те попали в новую реакционную смесь. Во время основной реакции этот термолабильный фермент уже будет неактивен, а фрагменты ДНК с абазическими сайтами претерпят гидролитическое расщепление.

Также для LAMP/RT-LAMP вам могут понадобиться

Примеры использования продукции New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP

Список литературы

Акции

Источник

Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой

Многие молекулярно-биологические операции напоминают поиск иголки в стоге сена

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Современные биологи в большинстве своём работают с генами. Ген — участок молекулы ДНК, кодирующий белок или РНК. Изучая активность гена и изменения в его работе, чаще всего пользуются методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и различными её модификациями. Метод позволяет найти ген и сделать множество его копий. Однако прибор и реактивы для проведения ПЦР дóроги, а время, необходимое на реакцию, составляет около двух часов. В данной статье описывается аналог полимеразной реакции — LAMP (loop-mediated isothermal amplification), позволяющий провести то же исследование в 10 раз быстрее, дешевле и, что крайне важно, более специфично. Также рассмотрены перспективы применения LAMP в фундаментальных и клинических исследованиях.

Конкурс «био/мол/текст»-2014

Эта работа представлена в номинации «Лучший обзор» и заслужила приз зрительских симпатий конкурса «био/мол/текст»-2014.

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Как это здорово звучит: я занимаюсь генетикой, работаю с ДНК, РНК, получаю ГМО. Как это странно выглядит: я добавляю прозрачные растворы к прозрачным растворам, ставлю в сложный прибор, который показывает, сколько у меня ДНК, или из каких нуклеотидов она состоит. Конечно, целая молекула ДНК, особенно в связи с белками, поддерживающими её структуру (aka хромосома), ещё видна в микроскоп, но представьте себе один ген, один небольшой участок хромосомы. Чтобы работать с одним геном, его нужно сначала найти. Представьте, найти определённый участок, состоящий из 10000 букв (нуклеотидов) среди 3 миллиардов таких же букв! Разница в пять порядков. Это действительно сравнимо с поиском иголки в стоге сена.

Первым механизм такого поиска в 1983 году запатентовал Кэри Мюллис (Kary Mullis) [1]. Он предложил наработать множество копий исследуемой ДНК. Чтобы понять метод Мюллиса, широко известный как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [11] и используемый уже более 30 лет практически в каждой лаборатории мира, обратимся к истокам. Как происходит увеличение количества ДНК в живом организме в естественных условиях.

Репликация ДНК

Природный механизм удвоения ДНК, который происходит перед делением каждой клетки, называется репликация (aka редупликация). Надо сказать, что до сих пор не все белки-участники данного процесса изучены, что говорит о его сложности. Главное, что происходит при репликации — сборка дочерней цепи ДНК на половине материнской. Напомню, что ДНК представляет собой двойную спираль, а информативная часть — азотистые основания — скрыта внутри спирали. Задача удвоения ДНК состоит в том, чтобы правильно собрать нуклеотиды в новую цепь и получить две идентичные молекулы. Собирает нуклеотиды фермент ДНК-полимераза. Но как ей добраться до азотистых оснований, скрытых в материнской цепи? Ответ прост — расплести цепи. Исполнение же трудно и требует участия целого ряда ферментов — гираз, лигаз, топоизомераз, белков, связывающих одиночную нить ДНК и препятствующих её повторному воссоединению (SSB белков). Тем не менее, ансамбль белков справляется с этой задачей (рис. 1). Итак, есть ДНК-полимераза, ей доступны азотистые основания матрицы, но что-то синтез не идёт.

Рисунок 1. Репликация ДНК. Обратите внимание, как много белков участвует в этом процессе.

Дело в том, что полимераза — фермент привередливый, синтез ДНК «с нуля» и не пойдёт: необходима затравка (праймер) — свободная OH-группа предыдущего нуклеотида или какого-либо белка. Теперь, присоединяя нуклеотиды к праймеру, ДНК-полимераза может копировать материнскую цепь.

Амплификация ДНК (ПЦР)

Амплификация — это искусственная многократная реплицкация. Итак, процесс репликации ДНК в клетке даже на настоящий момент изучен не до конца. Что же придумал Мюллис 30 лет назад? Как он смог скоординировать, по меньшей мере, десяток ферментов в один момент, о существовании части которых он даже и не знал? Представьте себе, никак. Он взял всего один фермент — ДНК-полимеразу. Доступ к азотистым основаниям обеспечил не белками, а плавлением. («Плавление» ДНК — неферментативное расхождение цепей при нагревании до 92–95 °C.)

Мы помним, что нужен праймер, чтобы «привередливая» полимераза начала работать. Добавляем 18—30-нуклеотидный фрагмент ДНК, комплементарный границе интересующей нас последовательности. Однако больших успехов все равно не получаем. Реакция идёт, но мы не можем сказать, что удваивается именно наш ген, потому что будут получаться фрагменты разной длины, зависящие от времени работы полимеразы и её активности. Как же понять, какой из образующихся продуктов — искомый?

В ответе на этот вопрос и появилась гениальная идея Мюллиса — надо брать не один праймер, а два: прямой (F) и обратный (R). Тогда мы будем знать длину нашего фрагмента и быстро увеличим его количество. Также Мюллис предложил проводить реакцию не один раз, а циклом 30–45 повторов. Математический подсчёт показывает, что количество продукта будет расти как 2 n (рис. 2), где n — число циклов. (А если бы использовался один праймер, то число фрагментов увеличивалось бы просто как n.) То есть через 30 циклов мы получаем в 10 9 (в миллиард) раз больше продукта, чем содержалось в исходном образце (а не в 30 раз больше, как было бы при использовании одного праймера). Почему же такая огромная разница? Дело в том, что при использовании двух праймеров каждый образующийся фрагмент служит матрицей в ходе следующих циклов. В случае одного праймера продукт будет ему не комплементарен и не будет использоваться как матрица в дальнейшем.

Рисунок 2. Схематическое изображение процесса полимеразной цепной реакции. Фиолетовым цветом показана исходная молекула ДНК, жёлтым — образующиеся в ходе реакции молекулы ДНК, идентичные исходной. Видно, что уже после третьего цикла число молекул увеличивается в 8 раз.

Рисунок 3. Цикл амплификации. Каждый цикл состоит из трёх ступеней: расхождение цепей ДНК, посадка праймеров и синтез новых цепей. Каждая ступень длится около 1 минуты. Таким образом, программа из 30 циклов будет длиться около 90 минут.

Сейчас проведение ПЦР занимает около 2 часов, благодаря использованию особой ДНК-полимеразы [2]. Дело в том, что каждый цикл ПЦР начинается с плавления ДНК на 95 °C (рис. 3), а «простая» полимераза — обычный белок — не выдерживала такой температуры и теряла функциональность, свернувшись, как белок варёного яйца. Поэтому по Мюллису после каждого цикла надо было добавлять новую порцию полимеразы. Рэнди Сайки (Randy Saiki) в 1986 году предложил использовать полимеразу из организма, живущего в термальных источниках — бактерии Thermophilus aquaticus (Taq-полимеразу), выдерживающую такой перегрев и работающую оптимально при 72 °C [3].

Как же теперь доказать, что, переливая прозрачные растворы, мы всё-таки не потеряли ДНК? Это можно увидеть глазами после 40-минутнтого разделения продуктов ПЦР в геле с помощью электрофореза. Гель — это, своего рода, молекулярное сито, сквозь которое под действием электрического тока идут молекулы: мелкие проходят быстро, крупные — медленно. Кроме того, фрагменты одинаковой длины концентрируются на одном уровне (а мы, следуя рекомендации Мюллиса, специально подбирали праймеры так, чтобы фрагменты были заданной длины). Всё это рассматривается в ультрафиолетовом (УФ) свете после добавления красителей, связывающихся с ДНК. В итоге мы увидим наш один ген или его фрагмент (или ничего не увидим, если искомой ДНК не было) (рис. 4).

Рисунок 4. Результат разделения продуктов ПЦР в агарозном геле. В качестве красителя, связывающего ДНК, использован бромистый этидий. Съёмка сделана в УФ-свете.

Итак, Мюллис предложил увеличить число иголок в разы, чтобы их блеск без труда можно было различить в сене не интересующей нас ДНК. В настоящее время существует множество модификаций ПЦР, применяемых для самых различных целей. Однако у этой реакции есть существенный минус — потребность в специализированном лабораторном оборудовании: термоциклере-амплификаторе (приборе, способном быстро менять температуру раствора столько раз, сколько нам нужно), камере для электрофореза и т.д. А если этого нет? Можно ли всё провести при одинаковой температуре — например, на водяной бане или в простом термостате? Оказалось, что это возможно, и есть целый ряд методов изотермической амплификации. Слово изотермическая означает, что реакция идёт при постоянной температуре. Наиболее быстрым, специфичным, дешёвым и часто используемым методом является опосредованная образованием петель изотермическая амплификация (loop-mediated isothermal amplification, LAMP). Итак, прольём свет этих LAMP.

Рисунок 5. Схематическое изображение метода LAMP. Для понимания метода вспомните, что синтез идёт от 3′- к 5′-концу (маленькие горизонтальные стрелочки), а обратно — никогда.

Метод LAMP, как и ПЦР, использует термостабильную полимеразу. Примечательно, что, когда искали полимеразу для реакции Мюллиса, нашли две — Taq, которая используется и по сей день для ПЦР, и Bst (из Bacillus stearothermophilus). Было показано, что Bst-полимераза нестабильна и быстро выходит из строя при 95 °C, да и документация к Taq была лучше. Однако у Bst есть преимущество перед Taq: она вымещает вторую цепь ДНК сама, без участия ферментов или использования высоких температур. Использование Bst в методе LAMP позволило проводить реакцию на 30–40 минут быстрее, поскольку исчезает потребность в первом шаге цикла, но это ещё далеко не всё.

В названии метода, кроме постоянства температуры, упоминаются ещё некие петли. Давайте разберёмся. Метод LAMP, описанный японским учёным Цугунори Нотоми (Tsugunori Notomi) в 2000 году [4], подразумевал использование четырех праймеров (пары внутренних и пары внешних), узнающих шесть различных участков искомой ДНК. Внутренние праймеры подобраны таким образом, чтобы сформировать те самые петли на концах искомого фрагмента (рис. 5). Чтобы это удалось, к 5′-концу праймера F2 прикреплена вторая часть, комплементарная F1 части матрицы, — F1c, то есть фрагмент F1c—F2 — это и есть внешний праймер, длинной до 50 нуклеотидов (F от forward, «прямой»). В результате, как только новая цепь ДНК останется одна, из-за вымещающей активности Bst-полимеразы её конец тут же замкнётся в петлю. То же происходит и с праймерами, садящимися на противоположный конец матрицы (B от backward, «обратный»). В конечном итоге, появится одноцепочечный фрагмент ДНК с петлями с обеих сторон — гантелевидная структура (dumbbell structure). На этом завершается первый шаг LAMP.

После получения «гантельки» с одного из её концов (3′) полимераза продолжает синтез к другому (5′), образуя «рукоятку» (stemloop). Концы «рукоятки», оказавшись в одноцепочечном состоянии, замыкаются в петли, продолжая синтез. Так постепенно формируются загзагообразные продукты.

Внешние праймеры (F3 и B3) необходимы лишь в самом начале реакции для разделения двух материнских цепей.

Такой метод позволяет быстрее нарабатывать продукт и длится от часа до получаса. Однако уже через два года этим же учёным удалось усовершенствовать свой метод, добавив ещё одну пару праймеров — петлевые праймеры [5]. При их использовании, предположительно, идёт наработка продукта с петель в обе стороны, а не в одну, как в оригинальном методе. Как показывает график из этой работы (рис. 6), уже через 10–20 минут можно было регистрировать продукт в достаточном количестве.

Рисунок 6. Сравнение эффективности LAMP с добавлением петлевых праймеров (пустые кружки) с классической LAMP (зачернённые кружки). По оси Х отложено время, по оси Y — изменение интенсивности флуоресценции (по нему можно судить об изменение количества ДНК в образце).

Да, как же регистрировать продукт в этой реакции? Представляете, просто взглянув на пробирку (не нужно ждать 40 минут), можно увидеть помутнение — это выпадает осадок пирофосфата магния. Ионы магния входят в состав реакционной среды, помогая работать Bst-полимеразе, а пирофосфат-ионы высвобождаются из нуклеотидов при синтезе цепи. Для верности можно также добавить краситель, связывающий ДНК и осветить УФ (рис. 7).

Рисунок 7. Визуализация результатов LAMP. Это одинаковые пробирки в естественном (слева) и УФ-свете (справа). В подписях указано исходное число молекул ДНК в пробе. Интересно, что даже 5 молекул ДНК в 25 мкл детектируются этим методом.

Сравнение ПЦР и LAMP

Таким образом, используя метод LAMP, можно ответить на вопрос «Присутствует ли интересующий нас ген в пробе?» за 5–20 минут [7], в то время как при использовании ПЦР ответа придётся ждать около двух часов, не считая времени на электрофоретическое разделение продуктов. Но, как известно, спешка хороша при ловле блох, а для научного исследования куда важнее точность и специфичность (то есть амплификация всегда и только той последовательности ДНК, которую мы задали, а не просто похожей).

Однако и тут LAMP опережает ПЦР. LAMP более специфичен, потому что ему необходимо узнать целых шесть участков в искомой молекуле ДНК, а ПЦР — только два (которые находятся непосредственно под праймерами). Но, что даже более важно, на LAMP не оказывает влияния присутствие биологических компонентов, зачастую не позволяющих провести ПЦР [8]. Исследуемый образец (например, слюну) можно заносить в реакционную смесь без очистки и искать гены вируса [6]. Благодаря этому свойству, LAMP используется в клинической практике для выявления патогенов человека и животных [9], определения пола коров до имплантации зародыша и даже нахождения метастазов прямо во время хирургической операции [10]. Метод прост в исполнении, дёшев (в отличие от других методов изотермической амплификации) и не требует ни сложной техники, ни обязательных биологических знаний.

Какой из методов лучше применять, зависит от эксперимента. Если исследователь постоянно меняет праймеры, условия или изучаемый ген, то ПЦР будет удобнее. Несмотря на то, что она занимает больше времени, на деле два часа едва хватает, чтобы приготовить смесь для следующей реакции и занести пробы в биохимический планшет. Если же речь идёт о предотвращении пандемии, и необходимо как можно быстрее определить присутствие известного вирусного агента, то, конечно, LAMP. Его можно применять, например, для мониторинга здоровья пассажиров в аэропортах стран, из которых возможно занесение вируса.

В заключение хочу отметить интересную тенденцию научных исследований, проявившуюся в эволюции методов амплификации нуклеиновых кислот. Как указано выше, во время создания ПЦР был выбор между двумя полимеразами: Taq и Bst. Мюллис выбрал Taq и построил свой метод на ней. А Нотоми спустя двадцать лет вернулся к Bst и придумал ещё более мощный метод LAMP.

Источник